Nicht-radioaktive Landmarker-DNA-Sondenmethode

Experimentelle Prinzipien

Früher wurde die DNA von Sonden mit radioaktiven Isotopen gekennzeichnet. In den letzten Jahren hat sich die Methode der nicht-isotopischen Markierung schnell entwickelt und es gibt einen Trend, die Methode der Isotopenmarkierung zu ersetzen. Die Geotope-Zufallsmarkering-DNA-Sondemethode ist eine erfolgreichere Methode zur Nicht-Isotope-Markierung (Saiki et al., 1985). Das Prinzip besteht darin, dass die Steroid-Semiantigen-Polymere auf dUTP (Dig-dUTP) mit chemischen Methoden verbunden werden. Mit zufälligen Prototypen und DNA-Polymerasen wird die DNA der Sonde als Vorlage verwendet, um komplementäre DNA zu synthetisieren, und das chemisch modifizierte dUTP wird gleichzeitig in die markierte DNA-Sonde integriert. Die mit einer alkalischen Phosphatase gekennzeichnete Antitopimab bindet sich nach der Hybridisierung an Dig-dUTP in der DNA der Markersonde, fügt ein farbiges Substrat hinzu und verwandelt sich unter der Wirkung der alkalischen Phosphatase in dunkelbraune oder blaue Verbindungen. Oder mit Röntgenfilm. Der grundlegende Prozess der Landmark-DNA ist: Vorbereitung der DNA-Sonde, Markierungssonde, Testprobe. Ein wichtiger Schritt besteht darin, eine hochempfindliche und spezifische Sonde zu erhalten.
Markierung: Mit der Methode der Random-Prototype-Markierung können bis zu 10ng bis zu 3ug DNA markiert werden. Jede 20-25 Nukleotide in der neu synthetisierten DNA-Kette können ein Dig-dUTP mit einer Reaktionszeit von etwa 1 h eingefügt werden.
Hybridisierung: Nach der Standard-Hybridisierungsmethode durchgeführt. Es kann eine Nylon- oder Zellulosenitrat-Membran verwendet werden. Die verwendete Hybridflüssigkeit kann bei -20 ° C gefroren und wiederverwendet werden.
Immunologischer Test: Nach der Blockade, der Schritt der Erkennung der Reaktion, die Antikörper-Bindungen an die markierte DNA binden, erscheint eine Hybridisierung der semi-antigen-markierte DNA, die Färbungsreaktion beginnt mit der Zugabe des farblosen Färbungsmittels X-Phosphat und Nitrolamtetrazol NBT unter alkalischen pH-Bedingungen, in wenigen Minuten beginnt das Erscheinen von Blau, der Prozess der Färbungsreaktion dauert 3 Tage. Ein typisches Beispiel ist die Beendigung der Farbreaktion nach 24 Stunden. Nach dem Waschen der Farbe auf der Nylonfolie mit Dimethylformamid kann die Nylonfolie wieder für die Hybridisierung verwendet werden.
Anwendung: Geometrisch markierte DNA-Sonden und Testkits, die 0,1 pg homogene DNA erkennen können, können eine einzige Kopie von Genen in 1 µg Säugetier-DAN erkennen, können im Vergleich zu einem radioaktiven Markierungssystem schnell Ergebnisse erhalten (von der DNA-Markierung und der Hybridisierung bis zum Testergebnis innerhalb von 24 Stunden) und beseitigen radioaktive Unsicherheiten. Die Empfindlichkeit und die Spezifizität des Reagents machen es für alle Hybridisierungstechniken geeignet (einschließlich DNA-Abdruckübertragung, Kolonialhybride, Phage-Hybridisierung und In-situ-Hybridisierung) als Ersatz für Isotopmarkierung und Radioautografie.

Experimentelle Reagenzien

1. Der DNA-Verdünnungspuffer verfügt über zwei Röhrchen mit jeweils 1 ml:

[Zusammensetzung: Tris-HCl (10 mM), EDTA (1 mM), pH 8,0 (20 ° C)] enthält Lachssperma-DNA (50 µg / ml).

2. Hexanukleotidmischung

3. Mischungssubstrat für die Markierung: Diese Röhre enthält 50 µl konzentriertes dNTP-markiertes Mischungssubstrat mit dATP (1 mL), dCTP (1 mM), dGTP (1 mM), dTTP (0,65 mM) und Dig-
dUTP (0,35 mM), pH 6,5 (20 ° C).

4. DNA-Polymerase-I-Segment (Markierstufe): In diesem Röhrchen sind 25 µl, DNA-Polymerase-I-Segment (Klenow), 2 U / µl.

5. (Dig) AP-Verbindung: In diesem Röhrchen sind 200 µl, polyklonierte Schafe-Anti-Erde-High-Distributor Fab-Fragment, die mit alkalischer Phosphatase 750 U / ml gebunden ist.

6. NBT hat zwei Röhrchen, je 1,25 ml, gelöst in 70% (V / V) Dimethylformamid Nitroblue Tetrazol Salzlösung (75 mg / ml).

X-Phosphat, zwei Röhrchen, je 0,9 ml, in Methylamidlösung von 5-Brom-4-Chlor-3-Piprophosphat in Dimethylformamid (50 mg/ml).

8. Blockierungsmittel, zwei Flaschen, jede Flasche mit 50 g Pulver.

Zubereitende Lösung:

EDTA (0,2 M), pH 8,0 (20 ℃)
LiCl (4M)
70 % (V/V) Ethanol
Tris-HCl (10mM)
EDTA (1mM), pH 8,0 (20 ℃)
Natriumsalz von 10 % (V/V)
10% (V / V) SDS
0.3M Trinatriumcitronat
3M NaCl
20×SSC
pH 7.0, Tris-HCl (100mM)
NaCl (150mM)
pH 7,5 Tris-HCl (100mM)
MgCl₂(50mM) pH 9,5 (20 ℃)
NaCl (100mM)

Experimentelle Schritte

1. Nehmen Sie 10 µl zu untersuchende DNA und führen Sie die Elektrophoresis auf 1,0% Gonalagel durch.

2. Das Gel wird mit Acetylbromid gefärbt, schneiden Sie den überschüssigen Teil des Gels und machen Sie eine Kennzeichnung in der Ecke des Gels, fotografieren Sie und erfassen Sie die Ergebnisse der Elektrophorese (beim Fotografieren setzen Sie einen Meter neben dem Gel).

3. Herstellung von Hybridklebstoffen
(1) Tauchen Sie das Gel für 15 Minuten in 30 ml 0,25 M HCl-Lösung ein, um die DNA zu entpurinieren.
(2) Waschen Sie das Gel zweimal kurz mit destilliertem Wasser.
(3) Tauchen Sie das Gel für 30 Minuten in 30 ml 0,4 M NaOH ein, so dass es neutralisiert wird.

4. Vorbereitung der Plattform für den Transfer von DNA vom Gel zur Membran
(1) Schneiden Sie 1 Blatt Nylonfilm und 3 dicke Filterpapiere in die gleiche Größe wie der zu übertragene Kleber und markieren Sie an der Ecke der Nylonfilm.
(2) Ein anderes dickes Filterpapier wird in die gleiche Breite wie das Gel geschnitten, die Länge (etwa 18 cm) ausreicht, um den Boden der Transferflüssigkeitsbox zu erreichen.
(3) Vorbereiten Sie 10 X SSC Transfer.
(4) Nachdem die zu verwendende Nylonmembran mit destilliertem Wasser getränkt wurde, tauchen Sie in 10 X SSC-Transfertflüssigkeit ein.

5. Installation der Kapillartransfervorrichtung
(1) Legen Sie das lange Filterpapier an der Oberseite der Transferplattform, und das Filterpapier erreicht die beiden Enden des Transferkastens und bildet eine Bogensaugbrücke.
(2) Gießen Sie 8 0mL Transferflüssigkeit in die Transferkaste und befeuchten Sie das Filterpapier.
(3) Legen Sie die Gel-Rückseite nach oben auf die Filterpapierbrücke, um Blasen zwischen Gel und Filterpapier zu vermeiden.
(4) Verschließen Sie die vier Seiten des Gels mit Schutzpapier.
(5) Legen Sie die getränkte Übertragungsmembran auf der Oberseite des Gels, um Blasen zwischen dem Gel und der Membran zu vermeiden.
(6) Legen Sie die übrigen 3 Filterpapierblätter vorsichtig auf die Übertragungsfolie und legen Sie einen Stapel von Wassersaugpapier auf das Filterpapier, dann eine Glasplatte, die eine schwere Sache druckt.
(7) Transfer für mehrere Stunden oder Übernachtung (mindestens 4 Stunden)
Achtung: Lassen Sie die Übertragungsflüssigkeit nicht trocknen.

6. Transferierte DNA ist mit Membranen verknüpft
(1) Legen Sie die Membran auf dickes Filterpapier mit 10 X SSC mit einer Seite der DNA nach oben.
(2) Legen Sie die Membran in den UV-Vernetzer (Crosslinker) und vernetzen sie automatisch bei UV-Licht für 3 min.
(3) Spülen Sie die vernetzten Membrane kurzzeitig mit destilliertem Wasser und trocknen Sie in der Luft.
Diese Folie kann langfristig bei 4 ° C gelagert werden.

MarkierungsDNA-Sonden Jede Standard-Reaktion kann 10ng bis 3ug lineare DNA markieren oder größere Mengen DNA markieren, aber alle Komponenten und Volumen werden entsprechend erhöht.

(1) Die DNA-Sonde ist thermisch degeneriert, kocht 10 min und kühlt schnell in Eis / Ethanol für mehr als 5 min ab.

(2) Nehmen Sie die Eppendorf-Röhre (1,5 ml) auf Eis und fügen Sie folgende und Reagenzien hinzu:

Frische DNA 1-3 µg

Hexanukleotidgemisch 2 µl

Mischungssubstrat für dNTP-Markierung 2µl

Steriles Schwerwasser auf 19 µl hinzufügen

DNA-Polymerase I (Klenow 5U/ul) 1 µl

(3) Isolierung bei 37 ° C mindestens 60 min, kann bis zu 20 h.

5 min kochen und die Reaktion beenden.

(5) 15.000 rpm Zentrifuge 30s, auf dem Eis zu verwenden.

8. Vorhybridisierung Drücken Sie 100cm²Die Membran verwendet 20-40 ml Vorhybridlösung, die bei der Vorhybridisierung in einem fließenden Zustand steht.

Zusammensetzung: 5 x SSC

0,5% (W/V) geschlossenes Reagenz: 1% Polysaccharose (Ficool 400), 1% PVP, 1% BSA.

0,1 % (W/V) N-Docanaylcreatin Natrium

0,02 % (W/V) SDS

Die Membran wird in einen Plastikbeutel gelegt, die Vorhybridierungsflüssigkeit gefüllt, nach der Entfernung des Gases versiegelt und über Nacht bei 65 ° C vorhybridiert.

9. Hybrid Drücken 100cm²Die Membran mit 2,5 ml Hybridflüssigkeit, gelegentlich schütteln Sie die Hybridbeutel während der Hybridisierung, so dass die Lösung im Inneren neu verteilt wird.

Hybridflüssige Zusammensetzung: 50% Formamid (V/V)

5 % (W/V) geschlossenes Reagenz

5×SSC

0,1(W/V)N-Docanaylcreatin Natrium

0,02 % (W / V) SDS

Neudegenerative DNA-Marker (150 ng/ml)

Die Hybridflüssigkeit ersetzt die Vorhybridflüssigkeit, wenn die Membran nicht trocknen kann, sollte der erfolgreiche Ersatz eine Schicht der Hybridflüssigkeitsfilm zwischen der Membran und dem Plastikbeutel bilden. Übernachten bei 42 ° C (16-20 h).

10. Film waschen Drücken 100cm²Die Membran wird mit 250 ml Waschmaschine berechnet.

(1) Spülen Sie 2x SSC / 0,1% (W / V) SDS-Lösung bei Raumtemperatur, 5min, 2mal.

(2) Spülen mit 0,1 x SSC / 0,1% SDS-Lösung bei 65 ° C, 10 min, 2 mal.

(3) Einmal mit 2x SSC-Lösung bei Raumtemperatur spülen.

11. Immunisierung

(1) Herstellungslösung

缓冲液1： Tris-HCl (100mM); NaCl (150mM) pH 7,5 (20 ℃)

Puffer 2: 0,5% (W / V) Blockierungsmittel (Rohr 11), in Puffer 1 zusammengesetzt (Blockierungsmittel wird nicht schnell gelöst, daher sollte diese Lösung 1 Stunde zuvor zusammengesetzt werden, das Reagenz bei 50 ~ 70 ° C gelöst wird, diese Lösung trüb bleibt).

缓冲液3： Tris-HCI (100mM); NaCI (100mM); MgCI2 (500mM) pH 9,5 (20 ° C).

缓冲液4： Tris-HCl (10mM); EDTA(1mM); pH 8,0 (20 ℃)

Färbungslösung: frisch zusammengesetzt, in 10 ml Puffer 3 45 µl NBT-Lösung (Röhre 9) und 35 µl X-Phosphatpuffer hinzufügen.

2) Farbprozess

A. Die Membran wird kurzzeitig in Puffer 1 gewaschen (1 min).

B. 30 min in 100 ml Puffer 2 isolieren.

C. Wieder kurzzeitig mit Puffer 1 waschen.

D. Antikörperbindungen mit Puffer 1 auf 150 U/L (1:5000) verdünnt; Die verdünnte Antikörperbindung ist bei 4 ° C nur 12 h stabil.

E. Die Membran wird 30 min in 20 ml verdünnten Antikörper-Verbindungslösung isoliert.

F. Waschen Sie den Film mit 100 ml Puffer 1, um die nicht gebundenen Antikörperbindungen zu entfernen, 15 min, 2 mal.

G. Die Membran in Puffer 3 für 2 min ausgeglichen.

H. Unter dunklen Bedingungen wird die Membran mit einer 10 ml Farbdesichtungslösung in eine Plastiktüte versiegelt oder in eine geeignete Box gelegt, die Farbe innerhalb weniger Minuten auftaucht, und die allgemeine Farbdesichtungsreaktion ist nach 1 Tag vollständig abgeschlossen. Wenn die Farbe erscheint, darf sie nicht geschwingt oder gerührt werden.

I. Wenn der gewünschte Punkt oder Band erkannt wurde, kann die Reaktion mit 50 ml Puffer für 5 Minuten beendet werden.

J. Die Kamera.

Beschreibung: Alle oben genannten Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt und müssen außer der Farbreaktion oszkuliert oder gerührt werden.

Hinweise

1. Berücksichtigung, wenn DNA nicht effektiv markiert werden kann

(1) Fällung mit Phenol/Extraktion und/oder Ethanol und Reinigung der DNA.

(2) Verlängerung der Isolationszeit der Markierungsreaktion (auf 20 h erhöht).

(3) DNA-Degeneration kann nicht* sein, was besonders wichtig ist für große Teile der DNA.

2. Berücksichtigung, wenn die gewünschte Empfindlichkeit nicht erreicht wird

(1) DNA-Markierungsrate.

(2) Erhöhung der Konzentration der markierten DNA oder Erhöhung der Hybridzeiten.

(3) Die Dauer der Farbreaktion kann auf 3 Tage verlängert werden.

Wenn der Hintergrund zu tief ist, können Sie

(1) Reduzieren Sie die Menge der markierten DNA in der Hybridlösung.

(2) Erhöhen Sie das Volumen der Hybridlösung, so dass die Membran willkürlich in der Lösung schwebt.

(3) Einige Arten von Nylon-Folien können dunklen Hintergrund haben, so dass andere Arten von Nylon-Folien verwendet werden können oder anstelle von Zellulosenitrat-Folien verwendet werden können.

(4) Erhöhung der Konzentration des blockierenden Reagents während der Kreuzung und der Prüfung.