Kosmetik in vitro Kollagen Synthese Förderung Test

Kosmetik in vitro Kollagen Synthese Förderung Test

Prüfprinzipien und technischer Weg

Kollagen ist ein zentraler Bestandteil für die Aufrechterhaltung der Hautelastizität und seine synthetische Fähigkeit wirkt sich direkt auf die Faltenbekämpfung und die Reparaturfunktion der Haut aus. Tests zur Förderung der in vitro-Kollagen-Synthese in Kosmetik bewerten die stimulierenden Auswirkungen der Probanden auf die Kollagen-Biosynthese durch den Aufbau eines Fibrozellenkulturmodells, das die physiologische Umgebung der Haut simuliert. Das Testsystem untersucht menschliche Dermatogenen Fibrozellen (HDF) oder lebendige Fibrozellenlinien (z. B. NHDF) und verifiziert die Veränderungen in der Kollagen-Synthese unter standardisierten Kultivbedingungen (37 ° C, 5% CO₂, 95% Feuchtigkeit) auf Protein- und Genebene nach einer Probenintervention.

Die experimentelle Konstruktion verwendet die Konzentrationsgradientmethode (in der Regel 0,01%, 0,1% und 1% drei Dosierungsgruppen), synchronisiert die Leerkontrolle (ohne Serummedium) und die positive Kontrolle (Vitamin C 100 μmol / L), um die Vergleichbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Schlüsseltechnische Prinzipien basieren auf Fibrozellen, die die Kollagen-Sekretion von Typ I fördern, indem sie den TGF-β/Smad-Signalweg aktivieren und die COL1A1-Genexpression erhöhen. Die Prüfung erfordert eine synchrone Zytotoxicitäts-Validierung (MTT-Methode), die erfordert, dass die Probanden eine Zellenüberlebensrate von > 80% bei einer effektiven Konzentration haben und eine Störung der Zellprogramm oder Toxizität der Testergebnisse ausschließen.

Kernprüfungsmethoden und Standardisierungsprozesse

Proteinspiegel: ELISA zur Bestimmung des Kollagen Typ I

Die spezifische Detektion der Konzentration von Kollagen Typ I (COL1) in der Zellkultur-Oberflüssigkeit durch die Enzym-Bindung-Immunabsorptionsmethode (ELISA) erfolgt unter strikter Einhaltung der technischen Spezifikationen der GB/T 35828-2018 in vitro 3D-Hautmodell-Wirksamkeitsprüfung für Kosmetik. Zu den konkreten Schritten gehören:

Probenvorbehandlung: sammeln Sie 72 Stunden Intervention auf der Zell-Klärung, 4 ° 12.000 rpm Zentrifuge für 10 Minuten, um Verunreinigungen zu entfernen;

Antikörper Packung: 96 Loch Plate Packung mit Ratten Anti-Human COL1 Monoklonal Antikörper (1: 1000 Verdünnung), 4 ° C über Nacht inkubiert;

Antigen-Bindung: Die Gradientenverdünnte Probe und das Standardprodukt (0-200ng / ml) hinzufügen und 2 Stunden bei 37 ° C inkubieren;

Darstellungsreaktion: Hinzufügen von HRP-Markierungsmitteln (1:2000-Verdünnung) und TMB-Substraten, um die Absorption bei 450 nm Wellenlänge nach Beendigung der Reaktion zu bestimmen;

Datenberechnung: Durch die Konvertierung der COL1-Konzentration durch die Standardkurve wurde die relative Syntheserate berechnet, die die Versuchsgruppe mit der Kontrollgruppe verglichen, was eine Verbesserung des COL1-Gehalts um ≥20% im Vergleich zu der leeren Kontrollgruppe erforderte (p < 0,05).

Genniveau-Validierung: Echtzeit-PCR-Erkennung der COL1A1-Expression

Um die molekularen Mechanismen der Kollagen-Synthese aufzudecken, ist eine Echtzeit-Fluoreszenz-Quantitative-PCR (qPCR) erforderlich, um Änderungen in der Transkription des COL1A1-Gens zu erkennen, wie folgt:

GesamtRNA-Extraktion: Trizol-Methode zur Klärung der Zellen, Nanodrop-Messung der RNA-Konzentration (A260/A280 Verhältnis 1,8-2,0);

Reverse Transkription Reaktion: Synthese von cDNA mit PrimeScript RT Kit bei 37 ° C für 15 Minuten und 85 ° C für 5 Sekunden;

qPCR-Amplifikation: mit GAPDH als endogenem Gen, COL1A1-Anfangssequenz F: 5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3', R: 5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3', Amplifikation im LightCycler 480-System (95 ° C-Prädagogik 10 Minuten, 40 Zyklen: 95 ° C 15 Sekunden, 60 ° C 30 Sekunden);

Ergebnisanalyse: Die relative Expression von COL1A1 wird mit der Methode 2^(-ΔΔCt) berechnet, wobei die positive Probe die Genexpression um das 1,5-fache erhöhen muss und im Einklang mit der Tendenz der Veränderung des Proteinspiegels ist.

Qualitätskontrolle und Ergebnisbestimmungskriterien

Qualitätskontrolle des experimentellen Systems

Zellqualitätssicherung: Verwenden Sie die 3. bis 10. Generation von logarithmischen Wachstumszellen, die Impfdichte wird bei 5 x 104 Zellen / cm² kontrolliert, um sicherzustellen, dass die Zellkleberate > 90% ist;

Standardisierung des Reagents: das fetale Rinderserum muss durch einen Bronchogen-Test durchgeführt werden, die Bauchspeicheldrüsenkonzentration wird streng auf 0,25% und die EDTA-Zusatzmenge auf 0,02% kontrolliert;

Instrumentengenauigkeitsanforderungen: CO2-Temperaturschwankungen ≤ ± 0,1 ° C, pH-Werte 7,2-7,4 aufrechterhalten.

Methodische Validierung: ELISA-Methode intrapartielle Genauigkeit RSD < 8%, zwischen-partielle Genauigkeit RSD < 12%, Recyclingrate 90% -110%; qPCR-Vergrößerungseffizienz von 90% -110%, Korrelationskoeffizienz R² > 0,99.

Ergebnisse zur Festlegung der Schwelle

Basisbestimmungskriterien: Ein Proband kann bei einer nicht-zytotoxischen Konzentration (Überlebensrate > 80%) eine der folgenden Bedingungen erfüllen und als positiv bestimmt werden:

Typ I Kollagen Gehalt erhöht um ≥20% im Vergleich zur Leerkontrolle (ELISA-Methode, p<0.05);

COL1A1-Genexpression ≥ 1,5-fach erhöht (qPCR) p<0.05)。

Verstärkte Validierungsanforderungen: Für Produkte, die behaupten, dass sie die Kollagensynthese erheblich fördern, müssen gleichzeitig eine Erhöhung des Proteinspiegels um ≥30% und eine Erhöhung des Genenspiegels um ≥2-fach erfüllt werden und mindestens drei unabhängige Wiederholungsdaten zur Verfügung gestellt werden.

Technische Vorteile und Compliance

Hardware und technische Fähigkeiten

Das chinesische Prüfzentrum ist mit einem Labor für Biosicherheit der dritten Stufe ausgestattet. Die Kernausrüstung umfasst:

Vollautomatisches Zellkultursystem (Thermo Scientific Heracell VIOS): Überwachung und Alarm von Temperaturen und CO2-Konzentrationen in Echtzeit;

Hochdurchfluss-ELISA-Arbeitsstation (BioTek 800TS): Unterstützt 96 Proben zur gleichzeitigen Detektion mit einer Detektionsgrenze von bis zu 0,1 pg/ml;

Fluoreszenz-quantitatives PCR-Gerät (Roche LightCycler 96): mit Schnellkühlmodul, das ein einziges Experiment innerhalb von 2 Stunden durchführen kann;

Cellular Imaging System (Olympus IX73): Quantitative Analyse der Kollagen-Immunfluorescenz-Intensität in Kombination mit ImageJ-Software.

Qualifikation und Datenvertrauenswürdigkeit

Das Labor ist von CNAS (Zertifizierungsnummer CNAS L22006) und CMA akkreditiert und der Prüfprozess folgt streng:

Nationale Norm: GB / T 35828-2018 "Leitlinien für die Prüfung von in vitro Hautmodellen für Kosmetik";

Internationale Normen: OECD TG 439 für in vitro Hautstimulierungstests, ISO 10993-5 für zytotoxische Tests;

Branchenleitfaden: Leitlinien für die Bewertung von Kosmetik-Wirksamkeitsansprüchen des China Cosmetics Review Center (Ausgabe 2021).

Maßgeschneiderte Testdienstleistungen

Kompletter technischer Support für verschiedene Kosmetikartypen:

Rohstoff-Screening: in vitro-aktive Vorscreening von pflanzlichen Extrakten, Peptiden und anderen Wirkstoffen, um den Forschungs- und Entwicklungszyklus zu verkürzen;

Rezepturoptimierung: Bewertung der Auswirkungen von Konservierungsmitteln und Aromen auf die kollagensynthetische Aktivität und Optimierung des Komplexprogramms;

Stabilitätsprüfung: 28 Tage unter 4 ℃, 25 ℃, 40 ℃ Lagerung, die Wirkstoffabbau auf die Wirksamkeit zu überwachen;

Datenwertschöpfungsdienste: Bereitstellung einer tiefgehenden Dateninterpretation wie COL1A1-Genweganalyse, Berechnung der Wirkstoffe IC50/EC50.

Industrieanwendungen und typische Fälle

Ein Anti-Aging-Serum, das durch dieses Testsystem validiert wurde, zeigte, dass nach 48 Stunden der Intervention der 1-prozentigen Konzentrationsgruppe die Sekretion von COL1 von fibroblasten um 42,3% erhöht wurde (p < 0,01), die Expression von COL1A1 mRNA um das 2,1-fache erhöht wurde und die Überlebensrate von 91,7% erreichte. Diese Daten unterstützen erfolgreich ihre "Förderung der Kollagen-Synthese" Wirksamkeit Behauptung, und die entsprechenden Testberichte als Grundlage für die Einreichung von der National Pharmaceutical Administration anerkannt. Die Praxis hat gezeigt, dass standardisierte in vitro Kollagen-Synthese-Tests effektiv als Ersatz für herkömmliche Tierversuche sein können, während die Genauigkeit der Prüfung gewährleistet wird, die Forschungs- und Entwicklungskosten und ethische Kontroversen erheblich reduziert werden und wissenschaftliche und zuverlässige technische Unterstützung für die Bewertung der Wirksamkeit von Kosmetika bieten.