In vitro entzündungshemmende Wirksamkeitsprüfung von Kosmetik

In vitro entzündungshemmende Wirksamkeitsprüfung von Kosmetik

Prüfprinzipien und experimentelle Modellerstellung

Die in vitro entzündungshemmende Wirksamkeit von Kosmetika basiert auf einem Makrophagen-induzierten Entzündungsmodell (LPS), das die Inhibition der Entzündungsfaktorfreisetzung durch Probanden durch die Simulation pathophysiologischer Prozesse der Hautentzündungsreaktion bewertet. Das Experiment wählte als Modellzelle den Monokern-Makrophagen RAW 264.7 von Mäusen, die den NF-κB-Signalweg unter LPS-Stimulation aktivieren und entzündliche Medien wie Stickstoffmonoxid (NO), Interleukin-6 (IL-6) und Tumor Necrotic Factor-α (TNF-α) in hoher Menge sekretieren, deren Freisetzungsgrad positiv mit dem Entzündungsgrad korreliert.

Schlüsselparameter des Modellbaus:

Zellinfektionsdichte: 5 x 104 Zellen/Loch (96 Loch Plate)

LPS-Stimulationskonzentration: 1 μg/ml (Sigma-Aldrich L2630)

Probenbehandlungszeit: 2 h nach der Vorbehandlung kombinierte LPS-Stimulation 24 h

Positive Kontrolle: Desisamison (1 μmol / L, Inhibition ≥ 80%)

Das Experiment muss fünf Konzentrationsgradiente (0,01% ~ 1%) und eine leere Kontrollgruppe festlegen, um die Überlebensrate der Zellen > 80% durch die MTT-Methode zu verifizieren, um sicherzustellen, dass die Testergebnisse nicht durch Zytotoxizität gestört werden.

Kernprüfungsindikatoren und Methodenvalidierung

Messung der Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO)

Der Gehalt an NO-Metaboliten-Nitrinaten in der zellulären Flüssigkeit wurde quantitativ mit der Griess-Reagentifarbung (Sigma-Aldrich G4410) untersucht. Der Prüfprozess umfasst:

Probenvorbehandlung: Nehmen Sie 50 μL Zellstoff und mischen Sie es mit einem gleichwertigen Griess-Reagenz

Inkubationsbedingungen: 37 ° C Lichtschutzreaktion 15min

Prüfgerät: Absorptionsmessgerät mit Thermo Multiskan FC 540 nm Wellenlänge

Berechnungsmethode: Berechnen Sie die NO-Konzentration mit der Standardkurve von Natriumiaxiat (0-100 μmol / L), Entzündungshemmung = (Mittelwert der Modellgruppe - Mittelwert der Probanden) / (Mittelwert der Modellgruppe - Mittelwert der Leergruppe) × 100%

Methodik Validierung Anforderungen: Standardkurve R²> 0,99. tägliche Genauigkeit RSD < 5%, Rückgewinnungsrate 90% ~ 110%.

Entzündungsfaktor (IL-6/TNF-α)

Mit Dual Antibody Clamping ELISA (R&D Systems Kit) sind die spezifischen Parameter wie folgt:

IL-6-Detektionsbereich: 7,8 bis 500 pg / mL, maximale Di-Detektionsgrenze 3,9 pg / mL

TNF-α-Detektionsbereich: 15,6 bis 1000 pg / mL, maximale di-Detektionsgrenze 7,8 pg / mL

Betriebsschritt: Probenverdünnung → Probeninkubation → Plattenwaschen → Enzym-Marker-Bindung → Farbdesignation (TMB-Substrat) → Beendigung der Reaktion (2mol / L H2SO4) → 450 nm-Messung

Datenanforderungen: Die IL-6/TNF-α-Spiegel in der Probengruppe waren ≥30% niedriger als in der Modellgruppe und der Unterschied war statistisch signifikant (unabhängige Probe-T-Test, p<0.05)

Standardbasis und Qualitätskontrollsystem

Die gesamte Prüfung entspricht streng der OECD TG 442E (2018) "In vitro-Prüfmethoden für Hautirritation / Korrosion" und GB / T 35892-2018 "In vitro-Prüfmethoden für 3D-Hautmodelle für Kosmetik". Zu den wichtigsten Qualitätskontrollmaßnahmen gehören:

Zelllinienzertifizierung: RAW-264.7-Zellen (ATCC TIB-71) mit STR-Identifizierung mit einer Übertragungszahl unter 20 Generationen

Rückverfolgung des Reagents: LPS-Endotoxinaktivität ≥ 1 x 106 EU / mg, ELISA-Kit-Batch-Variationskoeffizient < 10%

Umgebungssteuerung: CO2-Ausbau (37 °C ± 0,5 °C, 5 % CO2), ultrareiner Arbeitstisch (ISO-Klasse 5)

Datenvalidität: 3 Komplexlöcher pro Konzentration eingestellt, Experimente wiederholt 3 Mal, Variationskoeffizient innerhalb der Gruppe < 15%

Prüfprozess- und Ergebnisbestimmungskriterien

Vollständiger Versuchsprozess

Zellvorbereitung: Erholung von RAW 264.7-Zellen mit DMEM-Medium, das 10% fetales Rinderseru enthält

Probenbehandlung: Kosmetikproben mit einem Medium auf die festgelegte Konzentration verdünnen und mit 0,22 μm Filter sterilisieren

Entzündungsinduzierung: Hinzufügen von LPS (Endkonzentration 1 μg / mL) Stimulation 24h, sammeln Sie die Zellstoff

Indikator-Detektion: Synchronsmessung von NO (Griess-Methode) und IL-6/TNF-α (ELISA-Methode)

Datenanalyse: Statistische Analyse mit GraphPad Prism 9.0 zur Berechnung des IC50-Wertes

Ergebnisbestimmungskriterien

Hinweis: Für die Bestimmung der Wirksamkeit müssen gleichzeitig eine NO-Inhibition von ≥50% und eine IL-6 / TNF-α-Inhibition von ≥40% erreicht werden.

Technische Kompetenz der Prüfstelle

Das chinesische Testlabor ist CNAS-zertifiziert (Zertifizierungsnummer CNAS L22006) und verfügt über eine ausgereifte in vitro entzündungshemmende Technologieplattform, einschließlich:

Multifaktor-Detektionssystem: Luminex xMAP 200 (kann 10 Entzündungsfaktoren gleichzeitig erkennen)

High-Content-Bildgeber: PerkinElmer Operetta CLS (Zellmorphologische Analyse)

Automatisierte Arbeitsstation: Beckman Biomek 4000 (Vorbearbeitung der Probe)

Das Labor hat fast drei Jahre lang über 500 Chargen von kosmetischen entzündungshemmenden Testprojekten abgeschlossen, die Dosierungsformen von Cremen, Seren, Masken und anderen umfassen, und die Datendurchgängigkeit betrug 92,3%. Typische Fälle zeigen, dass ein beruhigendes Serum, das Amarantin-Extrakt enthält, bei einer Konzentration von 0,5% eine NO-Hemmungsrate von 62,7% und eine IL-6-Hemmungsrate von 58,3% beträgt, was dem Industriedurchschnitt (NO-Hemmungsrate von 41,2%) besser ist.

Anwendungsszenarien und Industriewerte

In vitro entzündungshemmende Tests werden hauptsächlich für die Wirksamkeitsprüfung von empfindlichen Muskelreparaturen, Akne- und Sonnenreparatur-Kosmetikprodukten verwendet, die Unternehmen die folgenden technischen Unterstützungen bieten können:

Formulierungsoptimierung: Screening der minimalen Zusatzmenge entzündungshemmender Wirkstoffe (z.

Konformitätserklärung: Erfüllung der Prüfanforderungen zur „beruhigenden“ Wirksamkeit in den Normen zur Bewertung von Kosmetikangaben

Wettbewerbsfähigkeit auf dem Markt: Steigerung der Produktwettbewerbsfähigkeit durch Testdaten von Drittanbietern, z. B. durch eine internationale Marke, die die Produktprämie um 20% erhöht

Mit den steigenden Anforderungen der Verbraucher an die Sicherheit von Kosmetika sind in vitro entzündungshemmende Tests zum Kernprojekt der Wirksamkeitsbewertung geworden. Das Labor empfiehlt Unternehmen, den Test bereits in der Produktentwicklungsphase einzuführen, um eine vollständige Evidence-Kette zu bilden, die sowohl die Produktkonformität als auch das Vertrauen des Marktes sicherstellt.