Spezielles Medium für Glattmuskelzellen der primären thoracischen Hauptarterie bei Ratten

Betriebspunkte:

Schritte der Zellkultur:

Vorbereitung von Kulturmitteln und Kultureinfrierungsbedingungen:

1) DMEM-H-Medium vorbereiten (NaHCO3 1,5 g/L hinzufügen), 90%; Rinderserum, 10%. Es ist auch möglich, das Suspensionsmittel entsprechend den experimentellen Bedürfnissen zu wählen, um 293T-Zellen zu suspendieren.

2) Kulturbedingungen: Gasphase: Luft, 95%; Kohlendioxid, 5 Prozent. Temperatur: 37 Grad Celsius, die Feuchtigkeit im Ausbauraum beträgt 70% -80%.

3) Gefrierflüssigkeit: 90% Medium, 10% DMSO, jetzt verfügbar. Flüssiger Stickstoff speichern.

2. Zellbehandlung:

1) Erholungszellen: Die Gefrierrohre mit 1 ml Zellsuspension werden schnell in einem 37 ° C-Wasserbad geschüttelt und aufgefroren und 4 ml Medium hinzugefügt, um gleichmäßig zu mischen. Zentrifugieren Sie bei 1000 RPM für 4 Minuten, entfernen Sie die Oberflüssigkeit und blasen Sie nach 1-2 ml Medium. Dann fügen Sie alle Zellsuspension in eine Kulturflasche, um über Nacht zu kultivieren (oder fügen Sie die Zellsuspension in eine 10-cm-Scheibe mit etwa 8 ml Medium, um über Nacht zu kultivieren). Am nächsten Tag wechseln und die Zelldichte prüfen.

2) Zelltransplantation: Wenn die Zelldichte 80% -90% beträgt, kann eine Zelltransplantation durchgeführt werden.

Für klebende Zellen kann sich die Übertragung auf folgende Methoden beziehen:

1. Entfernen Sie die Kultur und waschen Sie die Zellen 1-2 mal mit PBS ohne Kalzium- und Magnesiumionen.

2. Fügen Sie 2 ml Verdauungsflüssigkeit (0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA) in die Kultivflasche, in 37 ° C in der Kultivkammer für 1-2 Minuten zu verdauen, dann beobachten Sie die Zellverau unter dem Mikroskop, wenn die Zellen zum größten Teil runden und fallen, schnell wieder auf den Arbeitstisch, ein paar Klicks auf die Kultivflasche und fügen Sie eine kleine Menge Medium zur Verdauung zu beenden.

3. Drücken Sie 6-8 ml / Flasche, um das Medium zu ergänzen, nachdem Sie es sanft schlagen und aussaugen, 4 Minuten unter 1000 RPM zentrifizieren, die Oberflüssigkeit entfernen und 1-2 ml Kulturflüssigkeit ergänzen und ausblasen.

Verteilen Sie die Zellsuspension im Verhältnis von 1: 2 bis 1: 5 in neue Schalen oder Flaschen mit 8 ml Medium.

3) Zellfrieren: Wenn der Zellwachstumszustand gut ist, kann die Zellfrierung durchgeführt werden. Wenn die Zellen gefroren werden, fügen Sie eine kleine Menge des Mediums hinzu, nachdem die Zellen abgerundet sind, fügen Sie etwa 1 ml serumhaltiges Medium in die Gefrierröhre hinzu und fügen Sie 10% DMSO hinzu, um zu gefrieren.

Wie können Zellen gefriert werden?

Gefriererhaltung Methode 1: Gefrierrohr bei 4 ° C für 30 ~ 60 Minuten → (-20 ° C für 30 Minuten *) → -80 ° C für 16 ~ 18 Stunden (oder über Nacht) → Flüssiger Stickstoff Tank Dampfphase Langzeitlagerung.

Gefriererhaltungsmethode 2: Das Gefrierrohr wird in der programmierbaren Kühlmaschine des festgelegten Verfahrens auf 1-3 ° C bis -80 ° C pro Minute gelegt und dann in die Dampfphase des Flüssigstickstofftanks gelagert. -20 ° C darf nicht mehr als 1 Stunde, um zu verhindern, dass Eiskristalle zu groß sind und eine große Anzahl von Zellen sterben, können Sie diesen Schritt auch überspringen, um direkt in den Kühlschrank -80 ° C zu setzen, aber die Überlebensrate ist etwas geringer.