3T3-L1 (Mäusenbryogene Fibrozellen)

Methoden zur Zellhaltung:

a) Zellfrieren

1. Zubereitung einer gefrorenen Kulturflüssigkeit mit 10% DMSO oder Glycerin und 10 bis 20% Kalbserum;

2. Nimm die Logarithmus-Wachstumszellen, entferne die alte Kulturflüssigkeit und wasche sie mit PBS.

Entfernen Sie PBS und fügen Sie eine angemessene Menge hinzu (Abdeckung der Oberfläche der Petrischale), um die einschichtigen Zellen zu verdauen;

4. Zentrifuge 1000rpm, 5min;

5. Entfernen, fügen Sie die angemessene Menge der vorbereiteten Gefrierkultur hinzu, blasen Sie die Zellen sanft mit einer Suchte, um die Zellen gleichmäßig zu machen, zählen und regulieren Sie die endgültige Dichte der Zellen in der Gefrierkultur von 5 x 106 / ml bis 1 x 107 / ml;

6. Teilen Sie die Zellen in ein Gefrierrohr von 1 bis 1,5 ml pro Rohr;

7. den Namen der Zelle, die Dauer der Gefrierung und den Betreiber auf dem Gefrierrohr kennzeichnen;

8. Gefrieren: Das Standard-Gefrierverfahren ist eine Kühlgeschwindigkeit von -1 bis -2 ° C / min; Wenn die Temperatur unter -25 ° C liegt, kann sie auf -5 ° C bis -10 ° C / min erhöht werden; Bei -100 ° C kann man schnell in flüssigen Stickstoff eintauchen. Sie können auch das Gefrierrohr mit Zellen in den -20 ° C-Kühlschrank für 2 h legen und dann über Nacht in den -70 ° C-Kühlschrank legen, das Gefrierrohr entfernen und in einen flüssigen Stickstoffbehälter verschieben.

Produktinformationen:

Produktvorstellung:

Betriebsschritte:

1) Ersetzen Sie das halbe oder volle Medium 24-48 Stunden vor dem Gefrieren, damit die Zellen in einer exponentiellen Wachstumsphase sind.

2) Zubereitung der Gefrierkonservierungslösung (Zubereitung vor der Verwendung): Nehmen Sie eine andere Zentrifugerröhre, fügen Sie das Kulturmedium und das Serum hinzu, tropfenweise fügen Sie DMSO (DMSO) bis zu 20% Konzentration hinzu, das heißt, die doppelte Gefrierflüssigkeit, die bei Raumtemperatur verwendet wird.

3) Zentrifugal sammeln Sie die Zellen der Kultur, suspendieren Sie die Zellen mit dem Gewicht des Kulturmediums, das Serum hinzugefügt hat, und nehmen Sie eine kleine Menge Zellsuspension (ca. 0. 1 ml) zählt die Zellkonzentration und die Überlebensrate vor dem Gefrieren.

4) Nehmen Sie die gleiche Menge an Gefrierflüssigkeit wie die Zellsuspension, fügen Sie die Zellsuspension langsam tropfenweise hinzu und schütteln Sie das Prüfrohr, um eine Zellsuspension zu machen (DMSO nach der Konzentration von 5 bis 10%), so dass die Zellkonzentration von 1 bis 5 x 106 Zellen / ml ist, gleichmäßig gemischt, in den gekennzeichneten Gefrierkonservierungsrohren aufgeteilt, 1 bis 2 ml / Flasche, und nehmen Sie eine kleine Menge an Zellsuspension zur Kontaminationstest. Nach der strengen Abdichtung geben Sie den Zellnamen, die Algebra und das Datum an. Anschließend eingefroren.

Hinweis:

1) Die Zellen, die gefriert erhalten werden möchten, sollten in einem Zustand von gutem Wachstum und hoher Überlebensrate mit einer Dichte von etwa 80 bis 90% sein. Die Erkenntnis vor dem Gefrieren, ob die Zellen ihre Eigenschaften noch behalten, sollte ein bis zwei Tage vor der Gefrierkonservation auf die Herstellung von Antikörpern getestet werden.

2) Zellen können in flüssigem Stickstoff ohne Einfrieren für eine lange Zeit, ohne die Zellnehmlichkeit zu beeinträchtigen; Sie können mehrere Monate bei -70 Grad gelagert werden.

3) Achten Sie auf die Qualität des Gefrierschutzmittels. DMSO sollte auf Reagenzgrad, steril und farblos sein (mit 0. 22micron FGLP Telflon Filter oder direkt kaufen sterile Produkte, wie Sigma D-2650), in einem kleinen Volumen von 5 bis 10 ml, 4 ° C Lichtschutz, nicht mehrmals auftauen. Glycerol sollte auch als Reagenzgrad gehalten werden, um nach Sterilisation durch Hochdruckdampf vor Licht zu bewahren. Verwenden Sie es innerhalb eines Jahres nach der Eröffnung, da es nach langer Lagerung für die Zellen toxisch ist. Bei dieser Methode wird zuerst eine doppelte Gefrierflüssigkeit vorbereitet, um eine Schädigung der Zellen durch die durch die direkte Zugabe von DMSO freigegebene Wärme zu vermeiden. Die langsame Zugabe der Zellsuspension tropfen für tropfen ermöglicht es der Zelle, sich allmählich an die hohe Penetration anzupassen, was die Zellschädigung verringern kann. DMSO kann die Differenzierung einiger Leukämie-Zellstämme verursachen, die durch 10% Glycerin eingefroren werden können.

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