AFDye 647 NHS Ester Zellfärbung

aAFDye 647 NHS-Ester

(Alexa Fluor 647 NHS Ester Äquivalent)

Produktinformation

Produktbeschreibung

Dye 647 ist ein wasserlöslicher, stark lichtstabiler Farbstoff mit einer sehr hohen Lichtquantenleistung. AFDye 647 ist ein heller Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff, der mit 633nm oder 647nm-Laserspektrlinien angeregt werden kann. Geeignet für die Bildgebung von Zielen mit niedriger Fülle, insbesondere in stationären Zellen. Toleranz im pH-Bereich von 4 bis 10.

AFDye647 NHS ester (Äquivalent zu Alexa Fluor 647 NHS ester) ist ein Aminreaktionsfarbstoff, der weit infrarot fluoresziert und in der Regel Proteine oder Antikörper, Polypeptide, aminomodifizierte Oligonukleotide und andere aminohaltige Biomoleküle mit Betamin kennzeichnet. Dieser Marker ist in der Regel im pH-Bereich von 7-9 zui wirksam und bildet eine stabile und kovalente Aminbindung.

Produkteigenschaften

Lagerung und Transport

Aufbewahrung: -20 ° C vor Lichttrocknen aufbewahren, 2 Jahre gültig.

Transport: Eisbeuteltransport.

Hinweise

1) Es gibt Löschprobleme mit fluoreszierenden Farbstoffen, bitte achten Sie möglichst darauf, Licht zu vermeiden, um das Löschen der Fluoreszenz zu verlangsamen.

2) AFDye NHS Ester Serie Farbstoffe hat zwar eine gewisse Wasserlöslichkeit, aber es wird dringend empfohlen, die Mutterlösung mit DMSO und DMF zu lösen und anschließende Markierungsexperimente durchzuführen. Denn in wasserlöslichen Systemen werden diese reaktiven Gruppen sehr leicht zu einer nicht reaktiven freien Säureform hydrolysiert.

3) Für Ihre Sicherheit und Gesundheit tragen Sie bitte experimentelle Anzüge und Einweghandschuhe.

1. Färbungsschritt (z. B. Immunglobulin IgG Markierung)

Fast alle Proteine oder Polypeptide können mit Aminreaktionsmitteln (Sonden) gekennzeichnet werden. Im Folgenden sind die für IgG-Antikörper optimierten Markierungsschritte aufgeführt, bei denen der Benutzer das Reaktionssystem abhängig von seiner eigenen Proteinmenge vergrößern oder verkleinern kann, aber die Proteinkonzentration sollte nicht unter 2 mg/ml liegen, um ein ideales Färbungsergebnis zu erzielen. Aufgrund der großen Unterschiede in der Anzahl der Aminogenschaften, die in verschiedenen Proteinen (Polypeptide) enthalten sind, wird empfohlen, dass der Benutzer beim ersten Experiment drei verschiedene Gruppen von Aminoreaktionsmitteln erstellt: das Molenverhältnis des Proteins, um das Molenverhältnis zu screenen, das die Zuijia-Markierungseffizienz erreichen kann.

1,1 in 1 ml 0,1 M Kohlenstoff suan Natriumwasserstoff Puffer vollständig gelöst ~ 10 mg Protein.

Hinweis: Die Proteinkonzentration beträgt in der Regel 5-20 mg / ml, und die Erfolgsquote der gekoppelten Proteinkonzentration hängt stark von der Proteinkonzentration ab. Wenn die Konzentration unter 2 mg/ml liegt, beeinträchtigt dies die Markierungseffizienz erheblich.

Hinweis 2: Das Markierungssystem sollte jede aminhaltige Substrate wie Tris, Glycin, Ammoniumsalz oder andere stabile Proteine wie BSA vermeiden, wenn die zu markierende Proteinlösung die Kontamination der oben genannten Substanzen enthält, muss sie in 10-20 mM Phosphatpuffer (PBS) dialysiert werden und 0,1 ml 1M Carbohydratpuffer (pH 8,3-9,0) pro ml Proteinlösung hinzufügen, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen.

HINWEIS: Die niedrige Konzentration von Natrium-Pernitrogen (<3 mM) oder SchwefelQuecksilber (<1 mM) in der Antikörperlösung stört die Markierungsreaktion nicht.

1.2 Reaktion mit hochwertigem wasserlosem DMF oder DMSO-löstem Amin (Sonde) (z. B. AFDye647 NHS-Ester) bis 10 mg/ml.

Hinweis: AFDye 488 NHS Ester Wasserlösung muss zur Verfügung stehen, kann nicht aufbewahrt werden, da es in der Wasserlösung in eine inaktive freie Säure hydrolysiert wird. Die DMSO-Lagerflüssigkeit von AFDye 488 NHS Ester kann bei ≤-20 ° C gelagert werden und wird empfohlen, innerhalb von 2 Wochen zu verwenden.

1.3 50-100 µl Aminreaktionsmittel (Sonde) langsam hinzufügen, während man die Proteinlösung rührt oder wirbelt.

Hinweis: Die Menge des Aminreaktionsmittels (Sonde) beträgt 0,5-1 mg, insgesamt wird etwa 1/4-1/3 des Aminreaktionsmittels an das Protein gekoppelt. Unterschiedliche Proteine und Markierungsmittel haben unterschiedliche Markierungswirkungen, bitte optimieren Sie das Verhältnis beider je nach Situation.

1.4 Langsam bei Raumtemperatur rühren, um 1 h (oder länger) vor Licht zu inkubieren.

1,5 [Optional] Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml frisch zubereitetem 1,5 M Hydroxyamin (pH 8,5) und inkubieren Sie das Hydroxyamin enthaltende System 1 h bei Raumtemperatur.

1.6 Reinigung: Wählen Sie eine geeignete Methode (z. B. Dialyse, P-30-Säule oder PD-10-Säule) zur Reinigung des markierten Produkts, um Salzonen oder nicht reagierende Aminreaktionsmittel zu entfernen.

1.7 Lagerung: Gut gekennzeichnete Proteine vor Licht bei 2-8 ° C aufbewahren. Wenn die konzentration des gereinigten proteinkopplings < 1 mg / ml ist, fügen sie BSA oder ein anderes stabiles protein von 1-10 mg / ml hinzu. Unter Anwesenheit von 2mM Natrium-Stack kann 2-8 ° C für mehrere Monate gelagert werden. Wenn Sie länger aufbewahren möchten, müssen Sie nach der Aufteilung bei -20 ° C vor Licht aufbewahren, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden.

Berechnung des Markenverhältnisses (F/P-Wert)

Für die meisten Antikörper wie Immunglobulin IgG ist der molare Absorptionskoeffizient 203.000 und der F/P-Wert zwischen 4 und 9 am besten geeignet.
Berechnung des F/P-Wertes des AFDye647-Markers:
1) Verdünnen Sie eine Menge von wenigen gereinigten gekoppelten Proteinen mit PBS-Präzisionsmehrfachen und messen Sie die Lichtabsorption von 280nm und 650nm in einer 1 cm großen Scheibe;
2) Berechnen Sie die Proteinkonzentration in der Probe: Proteinmolkonzentration = (A280-(A650 x 0,03)) x Verdünnungsvermöglichung / 203000
3) Berechnung des Markerverhältnisses: Anzahl der Mole von Farbstoffen pro Mol Protein = A650 x Verdünnungsvermöglichung / (239.000 x Molkonzentration von Protein)

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Geschrieben/Bearbeitet von V. Shallan

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