Elektrotranszeptive Zellen von Agrobacterium Klonen und Expressionsanalyse

EHA105(pSoup) Elektrokompetente Zelle

Agrobacterium elektrotranssensive Zellen

Produktkennzeichnung:

der Stamm EHA105; Agrobacterium empfindliche Zellen; Rifampicin (Rif) Rifupin; Kanamycin (kan) Kanameicin; EHA101； LBA4404； GV3101； AGL1； genetisch veränderte Pflanzenforschung;

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Produktbeschreibung:

Der EHA105-Stamm wurde von dem EHA101-Stamm modifiziert, der Chromosom-Hintergrund C58 ist, das Nukleergen enthält das Screening-Label - das lifu-Plaintizitätsgen rif, um die Transformation zu erleichtern, trägt dieser Stamm das Bernstein-basierte Ti-Plasmid pEHA105 (pTiBo542DT-DNA), das das Vir-Gen enthält (das Vir-Gen ist ein wesentliches Element für die Einführung von T-DNA in das Pflanzengenom, obwohl die T-DNA-Transferfunktion des Plasmids selbst von pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) zerstört ist, kann jedoch helfen, die binäre Träger-T-DNA zu übertragen). Übertragen Sie den Stamm EHA105 in das help-Plasmid: pSoup, das heißt: EHA105 (pSoup) Stamm, der die pGreen, 62SK, pGs2-Serie von Plasmiden in Agrobacterien repliziert, während der Stamm Tetracyclin-Resistenz (tetR) verleiht, die für die genetisch veränderte Manipulation von Pflanzen wie Reis, Tabak und anderen geeignet ist.

Die EHA105 (pSoup) elektrotranssensiven Zellen, die von uns zur Verfügung gestellt werden, wurden durch ein spezielles Verfahren hergestellt, das sich besonders für die Transformation von großen Plasmoden eignet. Der Genotyp ist C58 (rifR) Ti pEHA105(pSoup) (pTiBo542DT-DNA) Succinamopin(pSoup-tetR) mit einer Transformationseffizienz > 105 cfu/μg DNA nach pGs2-Plasmoden.

Produktzusammensetzung:

Lager- und Transportbedingungen:

Lagerung: -80 ° C, 1 Jahr gültig.

Transport: Trockeneis.

Hinweise

1) Die empfindlichen Zellen sollten bei -80 ° C aufbewahrt werden, können nicht wiederholt gefriert und zu lange platziert werden, um die Transformationseffizienz der empfindlichen Zellen zu vermindern.

2) Der gesamte Umwandlungsvorgang wird streng nach den entsprechenden Temperatur- und sterilen Bedingungen durchgeführt.

3) Das Volumen des Plasmides sollte nicht größer als 1/10 des Volumens des Gefühls sein. Unreine Plasmide oder Kontamination mit organischen Substanzen wie Ethanol können zu einer drastischen Verringerung der Umwandlungseffizienz führen. Das Plasma verdoppelt sich und die Umwandlungseffizienz sinkt um eine Größenordnung.

4) Um eine hohe Umwandlungseffizienz zu gewährleisten, sollte der gesamte Betriebsprozess möglichst sanft und bei niedriger Temperatur gehalten werden.

5) Die Umwandlung von hohen Plasmakonzentrationen kann die Endbeschichtungsmenge entsprechend reduzieren.

6) Wenn die Klondichte auf der Tablette zu groß ist, wird das Klonvachstum aufgrund eines Mangels an Nährstoffen langsamer und die Kolonien kleiner. Um eine große Kolonie zu erhalten, sollte die Plasmidenmenge reduziert werden.

7) Der Zweck der Hinzufügung von Rifupin in das Kulturmedium ist es, das Wachstum von Bakterien zu verhindern und Agrobacterien zu screenen; Abhängig von der verwendeten Stammresistenz kann der Hinzufügen von Kettenmeixin oder Qingdaomeixin den Verlust von Ti-Plasmiden verhindern, aber Kettenmeixin ist nicht förderlich für den genetisch veränderten Betrieb von Agrobacterien, im Allgemeinen wird Kettenmeixin oder Qingdaomeixin nicht berücksichtigt, da die Wahrscheinlichkeit des Verlustes von Ti-Plasmiden sehr gering ist (im Wesentlichen vernachlässigbar).

8) Für Ihre Sicherheit und Gesundheit tragen Sie bitte experimentelle Anzüge und Einweghandschuhe.

Gebrauchsanweisung

1) Nehmen Sie den 0,1 cm Elektroschock-Becher und den Becherdeckel aus der Speicherflüssigkeit und legen Sie ihn 5 Minuten auf sauberem Absorbierpapier zurück, lassen Sie ihn 5 Minuten lang trocken sein, damit das Ethanol vollständig flüchtig und sauber ist, sofort in das Eis einfügen, verdichten Sie die Eisoberfläche, die Elektroden-Becher 0,5 cm von der Eisoberfläche entfernt, um den Becherdeckel zu decken und 5 Minuten im Eis zu halten, damit er vollständig gekühlt wird.

2) Nehmen Sie die -80 ° C erhaltenen Gefühlszellen in das Eis für 5 min, bis sie schmelzen.

3) Fügen Sie 0,01 ~ 1 μg (Volumen nicht größer als 6 μl) Plasmid-DNA in 50 μl empfindliche Zellsuspension hinzu, mischen Sie sie mit der Hand und fügen Sie sie sofort in das Eis ein. Mit einer Pistole sanft blasen gemischte Gefühlszustand Zellen-Plasmide nach der schnellen Übertragung in den Elektroschock-Becher, decken Sie den Becherdeckel, die leere Schlauche bleibt für den Gebrauch [Hinweis: Aufgrund der hohen Effizienz der Gefühlszustand-Transformation, die Zuihao einmal verwenden, um die Plasmidenmenge von Zuijia zu bestimmen].

4) Starten Sie den Transformer und setzen Sie die Parameter ein: C = 25 μF, PC = 200 Ohm, V = 2400 V (dieser Parameter bezieht sich auf Bio-rad, die spezifische Verwendung bezieht sich bitte auf die empfohlenen Schritte des Transformers), legen Sie den Elektroschock-Becher schnell in den Drehschlitz, und der Elektroschock wird schnell in das Eis eingesetzt.

5) Fügen Sie 700 μl antibiotikafreies LB hinzu und übertragen Sie es in eine empfindliche Luftröhre und kultivieren es 2 ~ 3 h bei 28 ° C.

6) 6.000 rpm Zentrifugieren 1min, halten Sie ca. 100ul Aufklarung, und anschließend mit einer Pistole sanft blasen Sie wieder suspendierte Bakterien. Anschließend werden LB- oder YEB-Tabletten mit entsprechenden Antibiotika hinzugefügt und die Zellen mit einem sterilen Glasstab vorsichtig gleichmäßig aufgetragen. Raumtemperatur 10 min, bis die Flüssigkeit absorbiert wird, umgekehrt Tabletten, 28 ° C Kultur für 2-3 Tage. [Hinweis: Wenn Tabletten nur die zweiträgigen Antibiotika enthalten, die für die Konvertierung verwendet werden, können sie bei 28 ° C 48 Stunden kultiviert werden; Wenn Tabletten mit Doppelträger-Antibiotika hinzugefügt werden, müssen 10 μg / ml Lifupin hinzugefügt werden, müssen 48-60 Stunden bei 28 ° C kultiviert werden; Wenn Tabletten mit Doppelträger-Antibiotika hinzugefügt werden, müssen 20 μg / ml Lifupin hinzugefügt werden, müssen 60-72 Stunden bei 28 ° C kultiviert werden; Es wird nicht empfohlen, mehr als 20 μg / ml Lifupin für Tabletten oder flüssige Kulturen zu verwenden.

7) Flüssigkeitskultur zum Zweck des Klones:

j Kleine Menge Shake: Fügen Sie 1ml flüssiges LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika in ein 15 ml Rundboden-Atemrohr hinzu, wählen Sie 1-2 Monokolonie-Impfungen aus frisch kultivierten Tabletten, 30 ° C, 200rpm Shake 24-48h.

k Viele Shaker: 100 ml atmungsaktive Dreieckflasche mit weniger als 20 ml LB flüssiges Kulturmedium mit entsprechenden Antibiotika, nehmen Sie die kleine Shaker-Flüssigkeit im Verhältnis von 2% zu sterilisieren, 30 ° C, 200rpm Shaker 24-48h.

Hinweis: Für Agrobacteria (Aerobics) benötigen sowohl feste Tabletten als auch flüssige Shaker eine große Menge Sauerstoff. Der Schlüssel zum Erfolg der flüssigen Shaker besteht darin, sicherzustellen, dass das Medium ausreichend gelösten Sauerstoff enthält, der durch folgende Methoden gesteuert werden kann: j mit einer luftdurchlässigen Probe oder einer Dreieckflasche; k Stellen Sie sicher, dass die Nährstoffflüssigkeit einen großen Querschnitt und eine kleine Dicke hat; l Antibiotika so wenig wie möglich oder nicht hinzugefügt werden, müssen Antibiotika in möglichst niedrigen Konzentrationen hinzugefügt werden.

Verwandte Produkte

Tabelle 1 Fest- und flüssige LB-Medium-Rezepturen

Tabelle 2 Fest- und flüssige YEB-Medium-Rezepturen

Tabelle 3 Zusammenfassung der häufigen Agrobacterien gegen Antibiotika

Geschrieben/Bearbeitet von V. Shallan

Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. ist ein Unternehmen für Reagenzien, Geräte und Laborverbrauch und experimentelle Dienstleistungen in den Bereichen Biowissenschaften und Biotechnologie, hauptsächlich in der Zellbiologie, Botanik, Molekularbiologie, Immunologie, Biochemie und Proteomik. Forschung und Entwicklung von Biopharmazeutik und Diagnostik. Das Unternehmen hält sich an die Geschäftsphilosophie "Menschen im Mittelpunkt, Ehrlichkeit und Vertragstreue". Die Einhaltung des Prinzips der "Qualitätssicherung" bietet unseren Kunden qualitativ hochwertige Produkte.