FITC-Annexin V/PI Apoptose Kit

FITC-Annexin V/PI Apoptose Kit

Produktnummer:F6012L

Produktspezifikationen:100T

Lagerbedingungen:

4℃Kühlen, bitte nicht einfrieren.Gültigkeitsdauer Verpackung.

Spektrale Eigenschaften:

FITC-Annexin V: Ex/Em = 494/518 nm

PI: Ex/Em = 535/617 nm (mit DNA)

Produktvorstellung:

FITC-Annexin V/PIApoptose Kits bieten eine schnelle und einfache Methode, durch die Markierung von frühen apoptotischen Zellen (grün) und Zellen mit nekrose oder später Apoptose(Rot) Erkennung der Apoptose. Produkte können mit einem Strömungszellometer oder anderen fluoreszierenden Prüfgeräten getestet werden.

Anhang V(Membranenprotein)- VEs ist ein Molekulargewicht von35-36KDderCa2+Abhängiges Phospholipidbindendes Protein (PSSelektive Kombination.Phosphatidyl (PSEs ist hauptsächlich auf der inneren Seite der Zellmembran verteilt, d.h. auf der Seite, die an das Zellplasma angrenzt. In den frühen Phasen der Apoptose werden verschiedene Zelltypen Phospholipide verarbeiten.Das Acyl wird auf die Zelloberfläche gedreht und in einer außerzellulären Umgebung ausgesetzt. Dabei wird eine grüne Fluoreszenzsonde verwendet.FITCMarkiertAnhang VDas heißt,FITC - Anhang V，Phosphatidyl mit Umkehr (PSIn Kombination mit dem Stromzytometer oder Fluoreszenzmikroskop zur direkten Erkennung der Externalisierung von Phospholidyl ist ein wichtiger Aspekt dieser ApoptoseZeichen. Für Zellen mit Nekrose oder später Apoptose, die aufgrund der Zellintegrität zerstört wurden,FITC - Anhang VSie können in das Plasma und auf der Innenseite der Phospholipidschicht gelangen.PSBinden, so dass auch die necrotic Zellen grün fluoreszieren.

Propylinijodid (Propidiumjodid, PI(ist eineDie DNAIn Kombination mit Farbstoffen kann es die Zellen von Zellen färben, die in der späten Phase der Apoptose die Integrität der Zellmembran verlieren.Zellkern.PIkann durch488、532 oder546 nmDer Laser wird angeregt und zeigt rote Fluoreszenz.

Verwendung:

1. Experimentale Konstruktion:

Leere Röhre: Negative Kontrollzellen, nicht hinzugefügtFITC-Annexin V/PI.Zur Regelung der Spannung.

Monochrome: positive Kontrollzellen, nurFITC-Anhang V/Nur hinzufügenPIZur Vereinbarung der Entschädigung.

Prüfrohr: behandelte Zellen, plusFITC-Annexin V/PI. Nach der Einstellung der Spannungskompensation mit leeren Röhren und einzelnen Färbungsrohren erhalten Sie die erforderlichen Stromdaten.

2. Sammlung von Zellen:

(1) Für suspendierte Zellen:

a.Nach der Stimulation der Apoptose,1000 Umdrehungen pro MinuteZentrifugieren5 MinutenEntfernen, Zellen sammeln, verwendenPBSDie Zellen aufhängen und zählen. Hinweis:PBSWiederholung kann nicht weggelassen werden,PBSDer Wiedersuspensionsprozess spielt auch die Rolle der Zellwaschung und kann eine Folge gewährleisten.FITC-Anhang Vdie Kombination.

b.取5×104 -1×105eine wiederaufhängende Zelle,1000 Umdrehungen pro MinuteZentrifugieren5 MinutenVerzicht, Beitritt100 µL 1 x Annexin VVerbinden Sie den Puffer, um die Zellen sanft wieder zu suspendieren.

c.beitreten5 µL FITC-Annexin VLeicht vermischt.

d.beitreten5 µL PIFärbung, leicht vermischen.

e.Raumtemperatur(20-25ºC)Lichtschutz Inkubation10 - 15 MinutenAluminiumfolie kann verwendet werden. Die Zellen können während der Inkubation wieder suspendiert werden2-3Zum Verbessern der Färbungswirkung.

(2) Für Wandzellen:

a.Die Zellkulturflüssigkeit wird in ein geeignetes Zentrifugerrohr abgesaugt.PBSWäsche die klebenden Zellen einmal und füge die richtige Menge an Zell-Verdauungsflüssigkeit hinzu(frei vonEDTA)Verdauungszellen. Raumtemperatur Inkubation, um sanft zu blasen, kann die klebenden Zellen aufblasen, wenn die Zelle Verdauungsflüssigkeit absorbiert. Überverdauung, die vermieden werden muss. Hinweis: Für klebende Zellen sind die Verdauungsschritte entscheidend. Wenn die Verdauungszeit zu kurz ist, müssen die Zellen stark schlagen, um zu fallen, was leicht zu einer Beschädigung der Zellmembran führt, was zu einem falschen Positiv für den Zellnekrot führt; Wenn die Verdauungszeit zu lang ist, ist es ebenso leicht, die Zellmembranschäden zu verursachen, dass ein falsches Positiv für den Zellnakdot auftritt und sogar das Phospholipidyl auf der Zellmembran beeinflusst.FITC-Anhang VDie Bindung stört somit die Erkennung der Apoptose.

b.Fügen Sie die im vorherigen Schritt gesammelte Zellkulturflüssigkeit hinzu, blasen Sie die Zellen sanft ab und übertragen Sie sie in das Zentrifugerrohr,1000 Umdrehungen pro MinuteZentrifugieren5 MinutenEntfernen, Zellen sammeln, verwendenPBSDie Zellen aufhängen und zählen. Hinweis: Es ist wichtig, die Zellkultur in den vorangegangenen Schritten hinzuzufügen, einerseits können bereits suspendierte Zellen, die Apoptose oder Nekrose auftreten, sammeln und andererseits können die Sera in der Zellkultur wirksam hemmen oder neutralisieren Reste. Der Rest wird verdaut und nachfolgend abgebaut.FITC-Anhang VDies führt zu einem Fehlschlag der Färbung.

c.取5×104 -1×105eine wiederaufhängende Zelle,1000 Umdrehungen pro MinuteZentrifugieren5 MinutenVerzicht, Beitritt100 µL 1 x Annexin VVerbinden Sie den Puffer, um die Zellen sanft wieder zu suspendieren.

d.beitreten5 µL FITC-Annexin VLeicht vermischt.

e.beitreten5 µL PIFärbung, leicht vermischen.

f.Raumtemperatur(20-25ºC)Lichtschutz Inkubation10 - 15 MinutenAluminiumfolie kann verwendet werden. Die Zellen können während der Inkubation wieder suspendiert werden2-3Zum Verbessern der Färbungswirkung.

3. Ergebnisanalyse:

(1) Stromzytometrie:

a. Nach Inkubation können 400 μL 1 x Annexin V-Bindungspuffer-resuspendierte Zellen direkt hinzugefügt werden, sofort an Bord nachgewiesen werden, FITC-Annexin V wird durch 488 nm Laser angeregt und das Fluoreszenz-Emissionsspektrum bei 530 nm (FITC-Kanal) und das PI-Kanal-Emissionsspektrum bei etwa 617 nm nachgewiesen werden.

b. Im Streudiagramm des Dual-Variable-Flow-Zytometers zeigt der untere linke Quadrant lebende Zellen (FITC-Annexin V-/PI-); Der untere rechte Quadrant ist eine frühe Apoptose (FITCAnnexin V+/PI-). Der obere rechte Quadrant ist die Knockout- und Spätapoptose (FITC-Annexin V + / PI +); Der obere linke Quadrant zeigt Nukleozellen (FITC-Annexin V-/PI+).

(2) Fluoreszenzmikroskopische Prüfung:

a. 1000 rpm Zentrifugieren für 5 min, sammeln Sie die Zellen und suspendieren Sie die Zellen leicht mit 400 µL 1 x Annexin V-Bindungspuffer. Bewegen Sie die Zellen in eine 96-Loch-Platte, um für einen Moment abzusetzen oder nach der Durchführung einer Zell-Beschichtung unter einem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.

b. FITC-Annexin V ist mit FITC-Filtern erhältlich, PI mit Cy3- oder Texas-Filtern.

Hinweis:

1. Bitte zentrifizieren Sie das Produkt vor der Verwendung sofort auf den Rohrboden und führen Sie anschließende Experimente durch.

2. Um die Apoptose zu verringern, kann der Inkubationsprozess auf Eis betrieben werden, aber die Inkubationszeit wird mindestens bis30 Minuten.

3. Da die Apoptose ein schneller Prozess ist, wird die Probe nach der Färbung empfohlen1 StundeAnalyse innerhalb.

4. Für klebende Zellen ist die Verdauung ein entscheidender Schritt. Wenn es schwimmende Zellen gibt, wenn die klebenden Zellen die Apoptose induzieren, müssen die schwimmenden Zellen und die klebenden Zellen nach der Fusion gefärbt werden. Handhabt mit klebenden Zellen vorsichtig und vermeidet möglichst künstliche Zellschäden. Die Verdauungszeit ist zu kurz, die Zellen müssen stark schlagen, um zu fallen, was leicht zu Schäden an der Zellmembran führt,PIZu viel Aufnahme; Die Verdauungszeit ist zu lang, die Zellmembran ist ebenso anfällig für Schäden und kann sogar Phospholidyl auf der Zellmembran beeinflussen.FITC-Anhang VKombination. Die Verdauung wird nach dem Boden der Bohrplatte gefüllt werden, wenn sie schwach mit den Zellen in vollem Kontakt stehen, dann gießen Sie den größten Teil aus, verwenden Sie die verbleibenden kleinen Mengen, um eine Weile zu verdauen, bis der Zwischenraum zwischen den Zellen vergrößert wird, kann der Flaschenboden fleckig beendet werden. Verwenden Sie es möglichst nicht in der Verdauungsflüssigkeit.EDTA，EDTAEs wird beeinflussen.Anhang VundPSdie Kombination.

5. Nach der Verdauung mit klebenden Zellen wird empfohlen, ca. in Kulturbedingungen und Medien wiederherzustellen30 MinutenNach der Färbung, um falsche Positive zu vermeiden.

6. Um den Verlust von Zellen beim Waschen zu vermeiden, können großeTippKlein auf dem Kopf.TippKopfsaug.

7. Die Verwendung von Farbstoffen wird durch spezifische experimentelle Anforderungen bestimmt.

8. Fluoreszenzfarbstoffe haben Löschprobleme, bitte achten Sie während der Aufbewahrung und Verwendung auf möglichst viel Licht, um das Fluoreszenzlaschen zu verlangsamen.

9. Aus Gründen Ihrer Sicherheit und Gesundheit tragen Sie bitte experimentelle Anzüge und Einweghandschuhe.