Mikrovaskuläre Endotelzellen der menschlichen Netzhaut

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Mikrovaskuläre endoteliale Trennung des Netzwerkgewebes; Die Netzhaut befindet sich in der inneren Schicht der Augenwand und ist eine transparente Schicht. Die Netzhaut besteht aus einer Pigmentepikortex und einer Netzhaut-Sensationsschicht, die sich unter pathologischen Umständen trennen können, die als Netzhaut-Trennung bezeichnet wird. Die Pigmentepithelie ist eng mit der Nervenmembran verbunden und besteht aus Pigmentepithelzellen, die die Lichtempfängerzellen unterstützen und nähren, die Licht verdunkeln, die Wärme abwerfen und sich regenerieren und reparieren. Histologisch unterteilt in10 Schichten, von außen nach innen sind: Pigment-Epikortex, Kegel, Visionsstab-Zellschicht, äußere Membran, äußere Partikelschicht, äußere Cluster-Schicht, innere Partikelschicht, innere Cluster-Schicht, ganglionelle Zellschicht, neuronale Faserschicht, innere Membran. Die innere Schicht der Netzhaut ist eine dünne Schicht, die im Inneren der Gefäßmembran ausgekleidet ist und eine Lichtempfindlichkeit hat; Auf der hinteren Seite der Nase gibt es eine Blicknerve-Brustwarze. Die sensorische Schicht der Netzhaut besteht aus drei Neuronen. Neuronen sind eine optische Zellschicht, spezialisiert auf Lichtempfindung und umfassen Kegelzellen und Stanzzellen. Sternzellen befinden sich hauptsächlich auf der Netzhaut, die weit entfernt von der zentralen Konjunktur ist, während Kegelzellen am meisten in der zentralen Konjunktur sind. Die zweite Schicht, die als Gangliozellen bezeichnet wird, verbindet etwa zehn bis hunderte optischer Zellen durch Gangliozellen mit einer gangliozellen Zelle, die für die Verbindungsfunktion verantwortlich ist. Die dritte Schicht nennt man Knotenzellschicht, die ausschließlich geleitet wird. Die Netzhaut ist eine dünne, aber sehr komplexe Struktur, die an die hintere Wand des Auges klebt und die Nervenfasern von Impulsen der Netzhautrezeptoren über die Oberfläche der Netzhaut und über den Sehnerv an den Ausgang führt. Die Auflösung der Netzhaut ist ungleichmäßig und in der Makulazone ist ihre Auflösungsfähigkeit stark. Es ist eine flache epiteliale Zelle, die die Oberfläche der Gefäßhöhle bildet. Die biologisch aktiven Substanzen, die sie erzeugt und sekretiert, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gefäßspannung, der Regulierung des Blutdrucks, der Antithrombologie und so weiter. Sie haben eine wichtige pathophysiologische Bedeutung bei der Entstehung von Netzwerkkrankheiten. Da Endotelzellen, die aus verschiedenen Geweben und Organen gewonnen werden, unterschiedliche Eigenschaften haben, im Gehirn und in der Netzhaut haben diese Endotelzellen eine Funktion der inneren Barriere und spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Gefäßphysiologischen Zustands, der Freisetzung von Gefäßaktiven Substanzen und der Bildung neuer Gefäße, ist die in vitro Isolationskultur RCEC von klinischer Bedeutung für die Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen der Entwicklung von Gefäßerkrankungen der Netzhaut und der frühen Behandlung von Erkrankungen.
Methodenbeschreibung:

Firma Labor Isolierung menschliche Netzhaut Mikrovaskuläre Endotel mit Collagenase- Neutrale Dan-Belase-Mischverdauungsmethode kombiniert mit Dichtegradienten-Zentrifugalmethode, schließlich durch Endotelzellen spezielle Medienkultur-Screening vorbereitet, die Gesamtzellmenge von etwa 5 x 10? Zellen und Flaschen.
Qualitätsprüfung:

Firma Labor Isolierung der menschlichen Netzhaut Mikrovaskuläre EndotheliologieCD31 Immunofluoreszenz-Identifizierung, Reinheit bis zu 90% und enthält keine HIV-1, HBV, HCV, Branchen, Bakterien, Hefe und Pilze.

Paket unter Bedingungen PLL（0.1mg/ml）， Gelatine (0,1 %)

Kulturmedium enthältFBS、 Wachstumsstoffe, Penicillin, Streptomycin usw.

Wechselfrequenz jeder2-3 Tage Wechsel

Wachstumsmerkmale Wandkleben

Zellmorm Endothelzellen

Übertragungseigenschaften Übertragbar2-3 Generationen

Verdauungsflüssigkeit 0,25 % Yi Protease

Aufbaubedingungen Gas: Luft,95%； CO2, 5 Prozent

Vorbereitung

1. Vorbereitung der Experimentausrüstung: Bereiten Sie sterile Petrischalen, Kulturflaschen, Pipetten, Zentrifugen, chirurgische Geräte usw. vor und führen Sie eine Hochdrucksterilisierung oder andere geeignete Desinfektionsbehandlung durch.

2. Vorbereitung von Reagenzien: Herstellung oder Kauf geeigneter Medien, Verdauungsenzyme (z. B. Kollagen usw.), Rinderserum, Dual Antibody und anderer Reagenzien, um sicherzustellen, dass sie steril und innerhalb der Gültigkeitsdauer sind.

3. Versuchstier oder Gewebequelle Vorbereitung: entsprechend den Versuchsbedürfnissen, die Auswahl der geeigneten Tiere und die entsprechende Anästhesie oder Hinrichtung, um das gewünschte Gewebe zu erhalten; Oder Organisationen aus einer vorhandenen Organisationsmodellbibliothek abrufen.

Entnahme und Bearbeitung

1. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen das Zielgewebe schnell, um die Gewebeschäden zu minimieren und überschüssiges Fett, Bindegewebe und andere nicht-Zweckgewebe zu entfernen.

Reinigung: Das entnommene Gewebe wird mehrmals mit vorgekühltem sterilen PBS gespült, um Blut und Verunreinigungen zu entfernen.

3. Schneiden: Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke von ca. 1 - 2 mm³ für die spätere Verdauung.

Zelltrennung

1. Verdauung: Die geschnittenen Gewebeblöcke werden in eine Zentrifuge mit einer angemessenen Menge an Verdauungsenzymen gelegt und für eine Weile in einem 37 ° C-thermostatischen Schüttelbett oder in einem Kulturkasten verdaut. Die Zentrifugerrohre können während der Zeit sanft geschüttelt werden, um die Verdauung gleichmäßiger zu machen.

2. Beenden der Verdauung: Wenn die Gewebeblöcke zum größten Teil in eine Einzelzellsuspension oder kleine Zellruppen verdaut werden, beendet die Verdauung durch das Hinzufügen eines serumhaltigen Mediums.

3. Filtern und Zentrifugieren: Filtern Sie die Zellsuspension mit einem Zellsieb, entfernen Sie unverdautes Gewebefragment und zentrifugieren Sie das Filter mit der richtigen Drehzahl, um die Zellalfällung zu sammeln.

Zellenbeobachtung und -prüfung

1. Tägliche Beobachtung: Täglich mit dem umgekehrten Mikroskop beobachten Sie die Zellmorm, den Wachstumszustand, die Dichte usw., um die Veränderungen der Zellen aufzuzeichnen, wie die Entdeckung von Zellverkontamination oder Anomalien, und rechtzeitig entsprechende Maßnahmen zu ergreifen.
2. Zellzählung und Vitalitätstest: Bei Bedarf können Zellzählungen und Vitalitätstest mit Methoden wie Taipanblau gefärbt werden, um das Wachstum und den Gesundheitszustand der Zellen zu verstehen.

1. Interview und Trennung

1. Schneller Betrieb

- Das Gewebe muss sofort nach der Entnahme verarbeitet werden, um eine langfristige Exposition an Raumtemperatur oder einer nicht nährstoffreichen Umgebung zu vermeiden.

- Spülen Sie das Gewebe mit sterilem PBS oder physiologischem Salzwasser, um Blut und Verunreinigungen zu entfernen.

2. Auswahl der Verdauungsenzyme

- Wählen Sie die Verdauungsenzyme je nach Gewebetyp, um zu vermeiden, dass übermäßige Verdauung zu Zellschäden führt.

Die Verdauungszeit muss streng kontrolliert werden (in der Regel 10-30 Minuten) und der Zustand der Zellallösung kann über ein Mikroskop beobachtet werden.

2. Optimierung der Anbaubedingungen

1. Auswahl des Mediums

Bei Verwendung von Medien, die Serum oder spezifische Wachstumsfaktoren enthalten (wie DMEM, RPMI 1640 usw.), müssen einige Zellen Insulin, EGF usw. hinzufügen.

- Vermeiden Sie den häufigen Austausch von Medium-Marken oder Chargen, um den Anpassungsstress der Zellen zu reduzieren.

2. Wand und Übertragung

- Die Fähigkeit der primären Zellen zu kleben ist schwach und kann verpackt werden, um Petri-Schalen (wie Kollagen, Polylysin) zu benötigen.

- Bei der Übertragung wird empfohlen, die Dichte bei 70% -80% zu kontrollieren, und übermäßige Konvergenz kann zu einer Kontaktunterdrückung und Differenzierung führen.

III. Verschmutzungskontrolle

1. Steriler Betrieb

- Der gesamte Betrieb auf dem Supernet-Tisch, die Verwendung von Einweg-Verbrauchsmaterialien, um Kreuzverschmutzung zu vermeiden.

- Dual Antibody kann dem Medium hinzugefügt werden, aber langfristige Anwendung kann die Zellaktivität beeinflussen.

2. Branchenprüfung

- Regelmäßige Erkennung von Branchen-Kontaminationen (z. B. PCR-Methode), die Zellen müssen rechtzeitig nach der Kontamination entsorgt werden.

4. Zustandsüberwachung

1. Tägliche Beobachtung

Prüfen Sie täglich die Zellmorm, Dichte und Mediumfarbe und wechseln Sie das Medium rechtzeitig (in der Regel alle 2-3 Tage).

Anomale Morphologie (z. B. Zellrundung, Zunahme von Fragmenten) kann auf Verschmutzung oder Mangel an Nährstoffen hinweisen.

2. Übertragung und Einfrieren

Eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen (in der Regel 5-10 Generationen) erfordert eine rechtzeitige Einfrierung der frühen Generationen.

- Die Gefrierflüssigkeit wird empfohlen, DMSO + Serum (oder spezielles Gefriermedium) zu verwenden und nach einer gradienten Abkühlung flüssigen Stickstoff zu speichern.